狂犬病是由狂犬病毒（lyssavirus）引发的急性致死性脑炎，其致死率接近100%，至今仍是全球公共卫生的重大威胁。世界卫生组织（WHO）统计显示，每年约有6万人死于狂犬病，其中95%的病例集中在非洲和亚洲的农村地区。病毒通过受感染动物的咬伤传播，犬类是主要宿主，但蝙蝠、狐狸等野生动物也构成潜在风险。尽管暴露后及时接种疫苗和注射狂犬病免疫球蛋白（RIG）可有效预防发病，但资源匮乏地区的疫苗可及性、抗体治疗成本及病毒遗传多样性导致的“免疫逃逸”问题，始终是防控的瓶颈。狂犬病毒表面的糖蛋白（G蛋白）作为唯一暴露的抗原，负责介导病毒进入宿主细胞，并成为中和抗体的核心靶标。然而，G蛋白的构象动态性（如pH依赖的前融合态与后融合态转换）和高达10%的自然序列变异，使得抗体疗法面临严峻挑战。理解G蛋白的功能约束位点及逃逸突变规律，是开发广谱疫苗和抗逃逸抗体的关键突破口。

　　2025年5月20日，由美国弗雷德·哈金森癌症研究中心的Jesse D. Bloom课题组领衔，联合多个研究团队在Cell Press细胞出版社期刊Cell Host & Microbe上在线发表了一篇题为“Deep mutational scanning of rabies glycoprotein defines mutational constraint and antibody-escape mutations”的研究性论文。研究首次采用假病毒深度突变扫描（DMS）技术，对狂犬病毒G蛋白的8227个单氨基酸突变进行了系统性功能与抗原性分析。通过构建高复杂度突变库、结合长读长测序（PacBio）和结构生物学手段，团队揭示了三大核心发现：（1）G蛋白的融合环、组氨酸pH感应簇及扩展中间态相互作用网络对突变高度敏感，这些区域可能成为疫苗稳定化设计的“禁区”；（2）临床使用的单克隆抗体（如17C7）逃逸位点已在自然毒株中广泛存在，且不同抗体的逃逸模式呈现显著空间异质性；（3）基于结构指导的脯氨酸突变策略可锁定G蛋白前融合构象，为下一代疫苗抗原设计提供了可操作性靶点。

　　研究团队基于慢病毒载体开发了一套高通量假病毒系统，能够将G蛋白突变与DNA条形码精确关联。该平台通过在慢病毒表面展示突变G蛋白，并利用单周期感染特性，安全地模拟病毒入侵过程。实验设计涵盖G蛋白胞外域433个位点的所有单氨基酸替换（含20个终止密码子对照），通过Twist Biosciences合成突变库，并采用双重复文库策略（Library A和B）确保数据稳健性。PacBio长读长测序显示，两个文库分别覆盖了83,706和89,327个突变变体，突变检出率超过99%，且关键功能位点（如H384）的缺失通过后续实验验证排除。通过感染293T细胞并检测逆转录DNA的丰度，研究人员量化了每个突变对细胞入侵的影响，验证实验证实深度扫描数据与单突变假病毒中和效价高度一致（r=0.91），凸显了平台的精确性与可重复性。

　　深度扫描数据揭示了G蛋白的功能敏感区与进化柔性区。融合环（73-79和117-125位点）作为病毒膜融合的核心元件，对非保守突变极度敏感：例如，F74L和Y77F因保留芳香环特性而部分耐受，但W121A则完全破坏功能。组氨酸簇（H86、H173、H397）被证实为pH依赖构象变化的“分子开关”，任何非组氨酸替换均导致入侵功能丧失。值得注意的是，扩展中间态的疏水核心（如Y145、V258）仅允许疏水性氨基酸替换，而前融合态中这些位点却呈溶剂暴露状态，暗示构象动态性对突变约束的双重调控。此外，二硫键（C189-C228）和脯氨酸转角（P89、P106）的破坏会显著影响蛋白折叠，进一步凸显了结构稳定性对功能的关键作用。

　　针对8种单克隆抗体（包括已上市的Rabishield抗体17C7和广谱抗体RVC20），研究通过梯度浓度中和实验绘制了全突变逃逸图谱。结果显示：（1）抗体逃逸位点高度集中于其表位界面，如17C7的逃逸热点位于G蛋白334-346位点，与冷冻电镜解析的抗体-G复合物结构完全吻合；（2）部分逃逸突变通过间接机制发挥作用，例如I338T在G蛋白中引入N336糖基化位点，通过空间位阻阻碍抗体结合；（3）广谱抗体（如RVA122）的逃逸位点数量少且突变耐受性低（如R333位点），这与其靶向进化保守区域相关。结构对比发现，尽管抗体与G蛋白存在多界面接触，但仅特定位点（如CR57的V230、RVC20的K226）的突变会显著削弱中和效力，提示表位中“热点残基”的存在。

　　通过对全球公开的7,122条G蛋白序列分析，研究发现所有测试抗体均面临自然逃逸风险。以17C7为例，其关键逃逸突变N336S和R346K在北美蝙蝠源毒株中出现频率较高，而犬源毒株中相对罕见。实验验证中，携带I338T的蝙蝠源毒株A12_2718对17C7完全耐药（IC505 μg/mL），而移除该突变后中和效价恢复至野生型水平。值得注意的是，某些逃逸突变（如R346S）在单一替换时仅部分降低中和活性，但在自然毒株中与其他突变协同后可完全逃逸，提示上位效应（epistasis）在预测中的重要性。这一发现强调了持续监测病毒进化与抗体组合疗法的必要性。

　　研究团队从深度扫描数据中挖掘出多个构象稳定化潜力位点。例如，前融合态特异性脯氨酸突变（H270P）可通过阻碍扩展中间态的形成，将G蛋白锁定于免疫原性更强的构象。类似策略在冠状病毒刺突蛋白（如SARS-CoV-2的S-2P设计）和副流感病毒（VSV-G）中已成功应用。实验显示，Q256P和S265P突变在不影响表面表达的前提下，显著抑制细胞入侵，印证了其构象锁定效应。此外，扩展中间态极性互作网络（如E45-D211-R213）的突变敏感性提示，破坏这些相互作用可能进一步稳定前融合态。这些发现为设计“不可逆”前融合疫苗抗原提供了多维度的工程化靶点。

　　综上，该研究构建了狂犬病毒G蛋白迄今最全面的突变功能图谱，通过整合假病毒高通量筛选、冷冻电镜结构分析和全球毒株进化追踪，团队揭示了病毒逃逸的分子逻辑与免疫干预的优化路径。未来，这些数据可直接用于指导抗体鸡尾酒疗法的组合设计（如避免逃逸位点重叠），并为基于结构的疫苗工程提供精准突变库。

　　此外，研究开发的Nextstrain可视化平台（）可实现实时逃逸突变预警，助力全球狂犬病防控网络的智能化升级。尽管该研究聚焦实验室适应的疫苗株（Pasteur株），但团队已验证其对自然毒株的预测能力，为跨株应用奠定了基础。下一步需探索突变间的协同效应及宿主受体互作对逃逸的影响，以全面提升预测模型的鲁棒性。总之，这项研究标志着狂犬病防治从“经验驱动”迈向“数据驱动”的新纪元，为终结这一古老疾病的威胁注入了科技强心剂。

　　原标题：《狂犬病糖蛋白深度突变扫描：全球首个全面解析抗体逃逸与病毒进化的关键图谱！ Cell Press论文速递》

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